咖啡因在骨肉瘤细胞株顺铂化疗中
增效作用的实验研究及临床应用
崔秋， 李鼎锋， 尉承泽，刘蜀彬，王磊，范海涛
[摘要] 目的 探讨咖啡因在骨肉瘤细胞株（OS-U2）顺铂化疗中的增效作用和临床应用效果。方法 骨肉瘤细胞株经不同浓度顺铂单药0.2ug/l，2ug/l，5ug/l，10ug/l，20ug/l作用及经分别添加0.2 mmol/L，2.0mmol/L咖啡因作用24，48，72小时，通过MTT法体外细胞毒性实验观察各组中OS-U2细胞增殖情况；应用流式细胞术分析各组中OS-U2的凋亡；在荧光显微镜下观察凋亡细胞的形态并记录其阳性率。对64例IIB期原发恶性骨肿瘤及13例骨转移癌患者，采用皮下埋植式动脉介入化疗系统，用顺铂（CDDP）100～120mg/m2 为主，联合安纳加(咖啡因)1～1.5g/m2治疗。
结果 在添加0.2 mmol/L，2.0mmol/L咖啡因的各浓度顺铂组中，骨肉瘤细胞的增殖能被明显抑制，其凋亡水平也明显升高。咖啡因对顺铂杀伤骨肉瘤细胞株（OS-U2）的这种增效作用存在量效及时效关系。骨痛RR 97%，骨病变影像改变RR71%，病理中重度以上化疗反应占86%，平均随访30个月，生存率85%。结论：咖啡因在骨肉瘤细胞株顺铂化疗中有显著的量效及时效作用，其机制是咖啡因能加强诱导骨肉瘤细胞凋亡，从而增强顺铂对骨肉瘤细胞株的杀伤作用。临床应用本疗法对恶性骨肿瘤临床、影像、病理疗效良好；CF有明显增强CDDP抗肿瘤作用。
[主题词] 细胞凋亡，顺铂，咖啡因，骨肉瘤
[科研资助]项目名称：CDDP与CF联合治疗骨与软组织恶性肿瘤的临床研究。项目编号：2003-3029骨肉瘤是好发于青少年，新辅助化疗已开展多年,骨肉瘤的5年生存率提高到60%～80%，对已发生患肢病理性骨折、肺转移等肿瘤患者疗效仍欠佳，多归因于肿瘤化疗过程中产生不同机制耐药性。近年随着研究的进一步深入,发现咖啡因有着潜在的逆转化疗耐药的作用。国内、外对咖啡因在多种肿瘤的增效作用进行过一系列令人鼓舞的研究。本研究的目的是进一步阐述咖啡因是否具有促进顺铂诱导骨肉瘤细胞凋亡的作用,为临床应用咖啡因治疗骨肉瘤提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料
人骨肉瘤OS-U2细胞株购于中科院上海细胞生物研究所, 咖啡因为 上海信宜产品；顺铂为澳大利亚产品；细胞凋亡检测试剂盒购于北京宝赛生物技术有限公司；DMEM 培养基为美国GIBCO公司产品；胎牛血清为北京天象鑫隆公司产品；MTT为西安宝信生物有限公司产品；流式细胞仪为 FACSort, 美国Becton Dickinson公司产品。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM培养液,在37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中常规培养,隔日换液,用含0.125%胰酶和0.02%EDTA消化液隔天消化、传代。
1.2.2 实验分组 OS-U2细胞株与浓度分别为0.2ug/l，2ug/l，5ug/l，10ug/l，20ug/l的顺铂作用以及与混合了0.2 mmol/L ，2.0mmol/L咖啡因的各浓度顺铂作。在37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中常规培养72小时。
1.2.2 MTT法检测咖啡因对人骨肉瘤OS-U2细胞增殖的影响 收集对数期生长状态良好的细胞,用含10％胎牛血清的DMEM调整细胞数至5×105/mL，并以1×104细胞/孔的密度接种于96孔板。细胞贴壁后，各孔添加不同浓度顺铂,至终浓度分别为为0.2ug/l，2ug/l，5ug/l，10ug/l，20ug/l。 为检测不同浓度咖啡因对顺铂的作用，实验中在不同浓度顺铂中分别加入浓度为0.2mM，2.0mM的咖啡因组，以未加入咖啡因组作为对照。实验中，每孔均设平行3孔。各孔以含10％胎牛血清的DMEM补足，使得各孔终体积为200ul。将细胞置于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养，分别培养24，48，72小时。培养中止前4小时，加入无菌MTT。培养结束后，使用酶联检测仪测得各组OD值。
1.2.3 流式细胞仪检测对骨肉瘤细胞凋亡的影响（annexinV/PI 双染色）。
为进一步阐明咖啡因对顺铂杀伤骨肉瘤细胞的作用，我们进行了骨肉瘤细胞在不同浓度顺铂与咖啡因作用下凋亡情况的检测。收集对数期生长状态良好的细胞,
用含10％胎牛血清的DMEM调整细胞数至1×106/mL，并以1×106细胞/孔的密度接种于24孔板。实验分组同上。分别培养24,48,72小时，收集各组细胞，按照凋亡试剂盒的说明进行染色。并用流式细胞仪进行检测。
1.2.4 骨肉瘤细胞凋亡情况荧光显微镜下观察
随后我们将经凋亡试剂盒染色后的各组细胞在甩片机上进行离心，并在荧光显微镜下观察结果。
1.2.5 统计学分析 实验数据用统计图表示，组间比较采用t检验。
1.3临床对象 1998年1月～2003年4月 骨恶性肿瘤化疗3次以上共77例。男性53例，女性24例，年龄8～80岁，平均年龄31岁。
其中骨肉瘤55例（8例为外院常规化疗后复发，3例为动脉介入化疗后复发），骨的原发性神经外胚瘤2例，恶性纤维组织细胞瘤3例骨巨细胞瘤4例，骨转移癌13例（肺癌4例、乳腺癌3例、肝癌2例、原发灶不明4例）。其中股骨上段10例，股骨下段31例，胫骨上段10例，胫骨下段1例，腓骨上段5例，肱骨上段4例，脊柱骨盆16例。
2.结果：
2.1通过MTT结果，我们发现，相同的顺铂、咖啡因浓度下，作用时间越长，细胞增殖能力越差。在同一时间下，剂量越高，细胞增殖能力越差。而在同一时间点，同一浓度下，加入咖啡因组对骨肉瘤细胞增殖能力的抑制作用更强。初步提示，高浓度顺铂对于骨肉瘤细胞OS-U2具有强的杀伤作用，而且添加咖啡因将会增强这一作用，这一作用随着时间的延长而增强。（图1 A、B、C，不同时间，不同浓度顺铂与不同浓度咖啡因作用下，骨肉瘤细胞增殖情况）
A图
B图
C图
图中A：0.2ug/l，B：2ug/l，C：5ug/l，D：10ug/l，E: 20ug/l
2.2 通过annexin V/PI 双染色，流式细胞术检测的方法，我们进一步检测了不同时间，不同浓度顺铂及咖啡因等条件作用下，骨肉瘤细胞凋亡水平的变化。结果发现，与MTT结果相似，在相同浓度顺铂及咖啡因的作用下，时间越长，骨肉瘤细胞的凋亡比例越大（结果未示出）。而在相同的时间，同一浓度顺铂作用下，加入浓度为咖啡因较咖啡因更容易诱导凋亡， 咖啡因浓度越高，骨肉瘤的凋亡比例越高。（图2 A, B）
10 ug/l顺铂 10 ug/l顺铂＋0.2ng/ml 10 ug/l 顺铂＋2ng/ml
A. 72 h 10ug/l顺铂单用与混合浓度0.2ng/ml、2.0ng/ml咖啡因作用下OS-U2细胞凋亡水平变化散点图。
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B. 72 h 10ug/l顺铂单用与混合浓度0.2ng/ml、2.0ng/ml咖啡因作用下OS-U2细胞凋亡水平变化统计图。
＊，与单用10 ug/l顺铂组相比较，P<0.01；
※，与10 ug/l顺铂＋0.2 ng/ml 咖啡因组相比，P<0.01。
3.3 荧光显微镜下的观察情况进一步说明了流式细胞术的分析结果。
1. 10 ug/l顺铂作72小时，AnnexinV+/PI+区的继发性坏死细胞比率大，PI高染率很高。
2. 10 ug/l顺铂＋0.2 mM咖啡因作用72小时，Annexin V+/PI+区的继发性坏死细胞，Annexin V和PI均高染。
3. 10 ug/l顺铂＋2.0 mM咖啡因72小时，Annexin V+/PI-区的凋亡细胞群，Annexin V的荧光强度高但PI强度低。
2.4经临床及影像学诊断后，积极完善术前准备，行埋置化疗装置，活检术[1，2]。可选用患侧股动脉，上肢选用患侧肱动脉，做小切口后顺行或逆行把导管插入肿瘤组织供血近端，在皮下置入埋植式动脉化疗装置后，进行切开活检。埋化疗泵当天，经化疗泵动脉给顺铂（CDDP）100～120mg/m2 ,长春新碱（VCR）1～2mg，静脉常规水化、利尿、止吐、保肝。输完顺铂2h后用5%葡萄糖或生理盐水1000ml+安纳加(咖啡因 CF)1～1.5g/m2/24h，，经化疗泵维持72h，部分病例辅用阿霉素（ADM）。
3.讨论：
提高化疗的效果,增加肿瘤对化疗的敏感度,是当前行之有效的改善骨肉瘤治疗效果的途径。Tsuchiya等[1]在应用顺铂联合咖啡因辅助化疗的基础上,对高度恶性的非转移性骨肉瘤进行边缘切除,发现可显著提高原发灶的肿瘤坏死率和边缘切除术的保肢成功率,5年累积生存率和无瘤生存率分别达91%和79%。尽管其具体机制尚不明了,但无论是从体外细胞毒性试验还是从本实验的体内药效学研究,以及一定数量的临床前瞻性研究[2－6],都表明咖啡因对骨肉瘤化疗有着明确的增效作用。这对骨肉瘤治疗疗效停滞不前的现状不能不说是一个令人鼓舞的前景。
本实验结果显示，咖啡因、顺铂对骨肉瘤细胞株均有一定的细胞毒性作用，低浓度的咖啡因与顺铂合用对骨肉瘤细胞株的毒性作用明显增强，且随着各自浓度的提高，对骨肉瘤细胞株的细胞毒性也进一步增强。说明咖啡因在骨肉瘤细胞株顺铂化疗中有显著的量增效增作用。
咖啡因能促进骨肉瘤细胞由G2/M期向G0/G1期移行，导致G2期缩短。有关咖啡因与顺铂协同作用机理尚不十分清楚，根据本研究结果推测1.咖啡因协同顺铂抗骨肉瘤的作用机理在于药物作用后，肿瘤细胞不能进行足够的DNA修复而进入分裂期，从而加速死亡；2.咖啡因可抑制化疗药物作用后肿瘤细胞DNA潜在致死性损伤的修复，咖啡因可抑制骨肉瘤细胞突变基因的修复；3.咖啡因在顺铂续灌作用于骨肉瘤细胞后才能够起到促进凋亡的过程的发生；4.咖啡因本身就是一种致DNA损伤的抗癌剂，其单独作用有类似肿瘤特异性的杀肿瘤细胞作用。
Annexin v是细胞凋亡的一种表面标记，PI是染细胞的核DNA，通常对于凋亡后DNA损伤后表达阳性。最初凋亡细胞膜表达Annexin v，在图片上是绿色的，随着进展，细胞核受损，即PI染色也呈阳性（红色），这时细胞绿色和红色同时表达（因为这是细胞还没有完全损害）。随着进展，细胞出现破裂，只剩下红色的还没有降解的DNA。
综上所述，通过实验证明咖啡因在骨肉瘤细胞株顺铂化疗中有显著的量效及时效作用，其机制是咖啡因能加强诱导骨肉瘤细胞凋亡，从而增强顺铂对骨肉瘤细胞株的杀伤作用。其具体杀伤机制还有待进一步实验证明。
参考文献：
1.Tsuchiyah,Tomitak,Moriy,etal.Caffeineassistedchemotherapyandminimizedtumorexcisionfornonmetastaticosteosarcoma[J].AnticancerRes,1998,18(13):657-666
2.SekineK,FujiiH,AbeF.Inductionofapoptosisbybestatininhumanleukemiccelllines[J].Leukemia,1999,13(5):729－734.
3.XiaoZ,ChenZ,Gunasekeraah,etal.Chk1MediatesSandG2ArreststhroughCdc25Adegrada-tioninresponsetoDNA-damagingagents[J].JBioChem,2003,278(24):21767-21773.
4.WanShung-lin,YangDi-sheng,FanShun-wu,etal.EnhancementeffectofcaffeineincombinedtreamentofosteosarcomaOS-732celllinewithhyperthermiaandcisplatin[J].ChineseJournalofOrthopeadics,2001,21(2):115-118.
5.WanShuang-lin,YangDi-sheng,FanShun-wu,etal.Experimentalstudyoncaffeinandcisplatininductionapoptosisofosteosarcomacellline(OS-732)[J].ChineseJournalofOrthopeadics,2003,23(2):161-164.
6.李 钧 裴仁模 张玉良等，咖啡因促进顺铂诱导骨肉瘤细胞凋亡的实验研究，中国矫形外科杂志，2003，11（14），975－976
